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护舍安对大肠杆菌的体外抑制作用研究
刘林艳1, 文利新1, 蒋政云2, 许道军1※
（1. 湖南农业大学动物医学院, 湖南长沙, 410128; 2. 长沙绿叶生物科技有限公司. 湖南长沙, 410125）
良好的畜舍环境对于疫病防控、提高动物的生长性能及饲料报酬等方面均具有重要作用[1,2]。动物体内外及畜舍环境均存在着种类繁多，数量巨大的微生物群落，正常状态下，这些微生物群落维持一个良好的微生态平衡，并与动物处于一个良好的共生状态，这对动物保持健康状态具有重要的意义[3]。但在畜牧生产中，由于动物的不断进出、频繁的消毒及抗菌药物的使用，均对微生态平衡状态产生影响。为了防止有害菌群的过度繁殖，大剂量的抗生素等药物被普遍使用，导致药物残留和耐药菌株的产生，已严重危害了人类健康。微生态制剂是近年发展起来的新型绿色添加剂，具有无残留、无毒副作用等特点，利用有益菌群来抑制或杀死有害菌，可显著改善养殖微生态环境，进而促进动物的生长发育和提高饲料利用率，达到生态防治的目的[3]。在养殖过程中定期、适量的补充有益微生物，抑制有害菌群的繁殖，对于维持良好的微生态平衡具有重要作用。
护舍安是湖南农业大学动物保健工程技术中心开发的一种畜舍微生态改良剂，主要由多种有益微生物组合及矿物吸附剂组成。该产品喷撒于畜舍环境中，通过有益微生物的增殖来快速的分解畜舍内部残留的饲料、动物排泄物，并通过益生菌分泌的多种抗菌物质来抑制有害微生物的繁殖；通过矿物吸附剂来快速的吸附环境中的有害代谢物、水分，有害气体等。通过干燥、吸附和补充有益菌等多种措施来达到快速建立良好畜舍环境的目的。该产品在大量的临床使用过程中，能够显著的降低仔猪黄白痢和母猪的产后感染，并能有效的降低抗生素的使用量。为了进一步的分析护舍安对畜舍病原微生物的影响，本研究选择猪场常见的大肠杆菌为研究对象，对护舍安对大肠杆菌的体外抑制作用进行了初步的研究，现报告如下：
作者简介：刘林艳（1982-），女，湖南益阳人，硕士研究生，主要从事药物化学研究，Email: liulinyan@yahoo.com.cn
* 通信作者，许道军(1978-)，男，湖南衡阳人，博士，主要从事动物生殖调控及猪舍环境控制关键性技术研究。E-mail：xudaojun@yahoo.com.cn
1 材料与方法
1.1 材料
护舍安由长沙绿叶生物科技有限公司提供。大肠杆菌由湖南农业大学动物医学院从仔猪白痢病料中分离培养。
1.2 方法
1.2.1 LB液体培养基配制
在950 ml去离子水中加入胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠5g、摇动容器直至溶质溶解，用 5mol/LNaOH调pH至7.0，去离子水定容至1L，0.1MPa，120℃灭菌20min。
1.2.2 LB固体培养基配制及培养皿制备
在LB液体培养基中按15g/L的比例加入琼脂粉，溶解均匀，0.1MPa，120℃灭菌20min。用吸管准确量取20mL培养基，加入已灭菌并干燥的玻璃培养皿内，室温下凝固并静置4-8h。
1.2.3 护舍安培养液制备
准确称取护舍安1g，加入无菌生理盐水100ml，置于37℃水浴摇床，200r/min培养30min。再取0.1ml置于200mlLB液体培养基中，37℃，200r/min摇瓶培养24h后备用。
1.2.4 大肠杆菌培养皿的制备
用接种环取单个大肠杆菌菌落接种于200mLLB液体培养基内，37℃，200r/min摇瓶培养12h。再取培养好的大肠杆菌培养液0.1mL，加入生理盐水9.9mL,混合均匀，取0.2mL稀释好的大肠杆菌菌液置于LB固体培养皿。用涂布器均匀涂布后备用。
1.2.5 护舍安对大肠杆菌的体外抑制试验
参照刘冬梅[4]等方法进行。在已涂布大肠杆菌的培养皿中小心放入牛津杯，轻压，加入培养24h的护舍安培养液0.2ml，盖上培养皿，置于37℃生化培养箱内培养12h观察。抑菌效果判断：抑菌圈直径≧15mm，为强抑菌作用；10～15mm为抑菌作用；5～10mm为弱抑菌或不完全抑菌作用；无抑菌圈的为不抑菌[2]。
2 、结果与分析
图1 护舍安培养液对大肠杆菌的体外抑制效果
从图1的结果可知，护舍安培养液对于大肠杆菌的抑菌圈边缘清晰，抑菌圈直径达25mm，属于强抑菌作用。这一结果表明，护舍安中含有的益生菌群在培养过程中，能够产生强烈抑制或杀死大肠杆菌的物质。
3 讨论
近年来，微生态制剂作为一种绿色饲料添加剂用于维护动物胃肠道的微生态平衡和健康方面已经取得了很大进展[6]，但是利用微生态制剂来提高动物生活环境的微生态平衡方面的应用尚处于起步阶段。动物的生活过程不断的与环境发生相互作用，良好的畜舍环境与动物的健康息息相关。畜舍环境中有机物含量丰富，主要包括动物的排泄物、皮屑、饲料残留等，这些有机物是微生物的天然培养基，条件适宜时，微生物能够在短时间内大量的增殖，单纯的抗生素或消毒药的使用难以有效的抑制有害微生物的繁殖。目前临床上使用的益生菌如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等能够在畜舍内部快速的繁殖，营养竞争性抑制有害菌的增殖，同时，利用益生菌自身分泌的抗菌素[7]、短杆菌肽、枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素等物质来抑制或杀灭有害微生物[8]，从而使畜舍环境维持在一个以益生菌占主体的微生态平衡状态，减少有害微生物对动物机体的危害作用。
本实验的结果也清晰表明，微生态制剂的培养液对于大肠杆菌的繁殖发挥了强烈的抑制或杀灭作用，这也很好的解释了护舍安在产房使用过程中，显著的降低了仔猪黄白痢及母猪的产道感染这一现象。护舍安特有的干燥、吸附和补充有益菌的特点，能够有效的保持畜舍一个良好的微生态环境，抑制有害菌群的繁殖，降低抗生素的使用量。该产品通过对畜舍微生态平衡的控制来达到疫病生物防控的目的。在当前我国养殖业存在的药物滥用、耐药菌株普遍存在、药物残留的背景下，该产品在动物健康养殖领域具有广阔的应用前景。
参考文献
[1] 王美芝, 吴中红, 刘继军, 等．标准化规模化猪场中猪舍的环境控制[J]. 猪业科学, 2011, 3: 28-31.
[2] 许道军, 文利新, 蒋政云. 猪病防控应重视环境控制[J]. 中国猪业, 2011, 7: 32-33.
[3] 刘力. 运用微生态平衡拯救畜禽规模化养殖[J]. 中国动物保健, 2007, 9: 19-21.
[4] 刘冬梅, 李理, 杨晓泉, 等. 用牛津杯法测定益生菌的抑菌活力[J]. 食品研究与开发, 2006, 27(3): 110-111.
[5] Clinical and Laboratory Standards Institute. CLSI Document M100－S18, Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. Eighteenth informational supplement [S].
[6] 窦茂鑫, 吴涛. 饲用微生态制剂的发展现状与应用性研究[J]. 饲料研究，2013, 1: 15-17.
[7] 徐海燕, 张志焱, 曹银生, 等. 枯草芽孢杆菌所产细菌素的理化性质及抑菌谱的研究[J]. 饲料博览, 2010, 4: 29-32.
[8] 高卫华. 芽孢杆菌胞外蛋白酶合成及抑菌功能的调控机制研究[D]. 南开大学 2010.
