摘要：为了研制无污染，无毒、副作用的绿色饲料添加剂，选择了马钱科植物――钩吻作材料进行了以下研究。①提取了活性成份――生物碱；②研究它对动物的毒性和无毒性剂量；③研究了它对动物的毒性机理和病理；④进行了它对动物免疫功能和对血液学影响的研究；⑤研究了它的促生长作用及其机理；⑥还进行了残留及临床增重试验研究。
关键词：钩吻活性成份毒性促生长添加剂
ResearchandUtilizationofGelsemiumelegansbenth
YuanhuiWenlixingJiangzhenyun
(AnimalscienceandtechnologycollegeofHunauAgriculturalUniversity,changsha,410128)
Abstract：Todevelopanapinoidfeedadditivewhichispollutionfree、avirulent、andsideeffectfree,thegelsemiumelegansbenth,avegetationofloganiacease,ischosentoperformseveralstudiesthereinafter；①extractactiveingredient――alkaloid；②studyitsvenenousandavirulentdosage；③studyitsvenenosmechanismandpathology；④analyzeitseffectonimmunologicfunctionandhaematology；⑤investigateitsgrowth-promotionandmachanism；⑥doresearchonresidueandweightincrementinclinic.
Key：Gelsemiumelegansbenth；ativeingredient；toxicity；growth-promotionadditives
随着养殖业的发展，饲料生产量年年攀升，全国每年生产全价饲料达到6000万吨，因而饲料添加剂量逐年增加，尤其是促生长添加剂品种繁多，例如高砷、高铜、高硒等矿物质元素添加剂，“瘦肉精”等激素添加剂，喹乙醇、抗菌素添加剂，从而造成砷、铜、从动物粪便排出至土壤→植物→动物往复循环，导致环境污染。有的则通过饲料―肉食品等食物链进人体内，引起人的过敏，应激，心脏病和繁殖障碍，对人的健康带来诸多危害。
为了保护生态环境，保护人类的身体健康，研制无污染、无毒、副作用的绿色饲料，实属必要。从1999年开始从植物中寻找既具有促生长作用，又无残留毒性的绿色饲料添加剂。在这种背景条件下，我们在翻阅大量文献资料和筛选的基础上，选择了钩吻这一在南方诸省生长量较多的植物为材料进行研究，现将研究结果报告如下：
1．钩吻及其生物碱的资料调查，我们查阅了大量资料，获得：
1.1钩吻的生态分布：钩吻，别名：断肠草、毒根、胡蔓藤、野葛，属马钱科植物，缠绕常
绿藤本（见图），主产于亚洲和北美。在中国主要分布在广西、云南、贵州、湖南、福建、
江西及浙江等地。在湖南，我们经民间调查和地考察，钩吻主要分布在郴州、永州、湘西等地。
1.2钩吻的民间应用情况：《本草纲目》曾载，“断肠草”人误食其叶者致死，而羊食其则大肥。猪羊食其叶不但无毒，而且还令其毛泽光润，增肥和防瘟之效。《广西中药志》记载：“当猪胃纳不良时，用钩吻饲喂，能增加食欲”。
《广东中兽医常用草药》记载，“钩吻可治牛羊肠炎”，该省养殖户定期给牛羊服用本植物，且有健胃、杀虫、快肥之效。据调查，民间有人采用60g钩吻/d给猪饲喂，仅喂3-5d后见猪食欲猛增，食饱即睡的效果。总之，江西、福建、广东、广西民间均有用钩吻喂猪的记载。
2．钩吻生物碱的提取、分离、鉴定及毒性剂量研究
2.1钩吻生物碱的提取、分离和鉴定
采用95%乙醇提取（100℃水浴回流）和氯仿（65℃回流）提取方法对钩吻生物碱进行了提取。采用薄层层析、柱层折分离，紫外扫描图谱比较的鉴定方法进行了鉴定。研究结果表明，醇提取方法较好，能实际应用。从广西玉林市郊采集的钩吻，经鉴定主要含有两种单体，一种为毒性最重的钩吻素子（koumine），另一种为植物中含量最多的钩吻素甲（Gelsemine）。[FS:PAGE]
2.2钩吻碱对动物的毒性及毒性、与无毒性剂量研究
将钩吻总碱提取物配成10mg/ml的溶液后进行小白鼠的LD50测定和亚慢性毒性试验，并观察其毒性剂量反应。
结果表明，钩吻总碱的ip小白鼠，其LD50为7.38mg/kg体重，LD50的95%可信限范围为6.76mg/kg-7.94mg/kg。亚慢性毒性试验结果表明；1/50LD50，1/25LD50和1/15LD50三个剂量组与空白组之间在30d试验期内，血液学组织病理学均无明显影响，且无统计学意义。进而说明，1/50LD50的剂量（0.492mg/kg）对小白鼠无明显毒性作用。
3．钩吻的毒性机理研究
3.1钩吻碱对呼吸、心率、血压的影响
取钩吻碱，分别按0.5mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg和8.0mg/kg体重，给家兔作静脉注射，采用MS302系统相连，记录其变化。结果表明，4.0mg/kg能抑制家兔的呼吸运动，后期呼吸不规则或间歇呼吸。4.0mg/kg的钩吻碱能使家兔心率减慢，心收缩力下降，导致心输出量减少，血压下降。这说明毒素直接作用于心脏和抑制延脑呼吸中枢，引起心率变化和呼吸中枢麻痹。
3.2钩吻碱对胃肠运动和子宫平滑肌的影响
采用静脉注射，按0.5mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg、8.0mg/kg体重和直接滴加（按0.1%、0.2%、0.4%、0.8%、1.6%浓度）钩吻碱的方法，观察了家兔在体肠运动和兔离体肠、子宫的收缩运动。观察结果表明，0.8%浓度的钩吻碱能轻微抑制家兔的肠蠕动和子宫的收缩，对平滑肌有直接抑制作用，但抑制效果比肾上腺素弱。
4．钩吻碱对动物的毒性病理学研究
4.1钩吻碱对动物的毒性病理
按每公斤干钩吻粉提取的钩吻碱0.519mg的量计算，并按0.8%能引起家兔毒性作用的剂量，折合成钩吻干粉，选择1%、2%、4%的钩吻干粉添加在肉仔鸡的日粮中，饲喂40d，当饲喂到20d后，2%添加量对肉鸡具有明显促生长作用；当添加量达到4%以上时，肉鸡出现体重减轻、流涎、垂头、嗜睡等毒性临床症状，并表现出全身毛血管扩张，所有内脏充血、间质性肺气肿、心力衰竭、肾出血的毒性病理变化。
4.2钩吻碱对动物的毒性剂量与无毒性剂量的确定
综上实验结果表明，钩吻总碱按0.5mg/kg体重供给，对动物不产生任何毒副作用；1.0mg/kg体重供给，对动物仅产生呼吸频率与幅度稍微改变的毒性，且维持时间10min，并无明显的生理和病理学改变；4.0mg/kg以上钩吻碱能引起动物中毒。按提取的钩吻碱量折算，钩吻干粉2%添加量在日粮中对肉鸡具有促进生长的作用。
5．钩吻的开发与利用研究
5.1钩吻对动物的复壮增重试验研究
取一日龄健康仔鸡60只，按单因素3处理、2重复随机试验设计（第1组为对照组，第2、3组为试验组），各组基本日粮相同，试验组加1%和2%钩吻干粉，饲喂40d，每天8时，15时定时饲喂，统计每天饲料消耗量，分别在5日龄、18日龄、30日龄和40日龄各组逐渐称重，试验结束时，经数据处理和统计分析表明，第2、3组平均未重较第1组（对照组）分别提高5.46%、10.75%，料肉比为：对照组，1:2.79，第2组1:2.66，第3组1:2.57。从而证明2%添加量为优。
5.2钩吻碱对动物的血液学及免疫功能的影响
5.2.1钩吻碱对小鼠血液学的影响
取体重18-25g小鼠40只，随机分为4组，每组10只，雌雄各半，第1组为空白组，第2,3,4组为试验组，每天各灌喂钩吻碱药液（10mg/ml）一次，按0.15mg/kg体重，0.30mg/kg和1.5mg/kg分别在灌药的第5d，第10d，断尾取血进行RBC数和Hb量测定。
测定结果表明，0.15mg/kg组在第5d和10d和0.3mg/kg组均能提高RBC总数，Hb含量，与对照组比较差异极显著（P<0.01），而1.5mg/kg组能降低RBC数和Hb量，与对照组比较，在第10d，降低极明显（P<0.01）。
5.2.2钩吻碱对肉鸡血液学的影响
选定80羽健康1日龄三黄鸡，经饲一周后，随机分为4组，每组20只，第1组为对照组，饲喂基础日粮，第2,3,4组为试验组，按基础日添加1.5%,2%,6%的钩吻干粉，饲喂49d。在试验的7d,21d,35d和49d日龄时，分别颈静脉采血进行RBC总数，Hb含量和血液生化指标的检测。
研究结果表明，添加钩吻干粉1.5%剂量、在21日龄时，能显著提高肉鸡RBC数量、TP含量、Hb量和Alb含量（P<0.01）。在2%添加量时，Hb含量极明显高于对照组（P<0.05），而RBC数，ALb含量、TP含量高于对照组（P<0.05），而6%添加时均能降低各种血液值。
肉鸡在21d龄时，1.0mg/kg和2mg/kg组，LDH、AKP、SGPT，SGOT酶活性与对照组比较，差异不显著（P>0.05），而6%组、其LDH、AKP、SGPT、SGOT活性高于对照组，胆碱酯酶（CHE）活性低于对照组，差异不显著（P<0.05）。 [FS:PAGE]
在49d龄时，1.5mg/kg和2mg/kg组与对照组比较，各种酶的活性差异不显著，但在6%的试验组，LDH、ALP极显著高于对照组（P<0.01），CHE活性显著低于对照组（P<0.05）。
从而说明，在基础日粮中添加1.0%、2%钩吻干粉能显著提高肉鸡的RBC数，Hb含量，总蛋白含量、白蛋白含量，而6%具有降低的毒性作用。
5.2.3钩吻碱对动物免疫功能的影响
采用上述试验的小白鼠和肉鸡，在检测血液学的同时，对其免疫学进行了检测，分别进行了实验动物的免疫器官（胸腺、脾脏）重量、外周ANAE+淋巴细胞数量、腹腔巨噬细胞吞噬功能测定，肉鸡玫瑰花环形成率的测定，肉鸡ND抗体效价检测。
检测结果表明，钩吻碱灌胃时对小鼠和肉鸡免疫功能的影响存在着剂量差异，0.3mg/kg剂量组能明显提高免疫功能（P<0.05），而1.5mg/kg以上，则能降低动物的免疫功能（P<0.05）；饲料添加钩喂干粉，2%或以下量时能提高肉鸡某些免疫功能指标，而6%剂量则能降低某些免疫功能指标。
6．钩吻碱促进动物生长机理研究
6.1钩吻碱对动物的镇静作用
取健康小白鼠预饲一周后随机分为5组，进行阈下剂量水合氯醛催眠作用；大白鼠激怒反应和小白鼠能量代谢影响的研究。研究结果表明，按0.5mg/kg体重组，使小白鼠的入睡率比对照组提高了一倍，1.5mg/kg组提高了6倍，而2.5mg/kg组则提高了8倍；由此说明，钩吻总碱三个剂量组均能协同阈下剂量的水合氯醛对小白鼠的睡眠作用。钩吻碱对大白鼠激怒反应实验表明，钩吻碱对大白鼠由止血钳所引起的激怒反应有很好的抑制作用，表现出镇静的效果。
钩吻碱对小白鼠的能量代谢影响实验表明，钩吻碱能减少机体的能量代谢损失，在非中毒剂量内且随剂量的增加，能量损失越少。
6.2钩吻碱对动物胃肠道运动的影响
取健康小白鼠40只，体重20±2g，随机分为4组，每组10只，按生理盐水10ml/kg体重和0.5mg、1.5mg、2.5mg/kg体重钩吻碱组，连续灌胃给药3d，未次给药前禁食24h，自由饮水，未次给药后30min，各鼠均以10%活性碳混悬液20ml/kg灌胃，30min后将小鼠脱颈椎处死，打开腹腔分离肠系膜，剪取上至幽门、下至回盲部的肠管，计算每只小鼠活性碳的移动距离与小肠全长的百分率。
实验研究表明，生理盐水组与钩吻碱3个不同剂量组对推进率呈现轻微抑制作用（P>0.05），且剂量的增大，其推进率下降，钩吻碱0.5mg/kg体重组、1.5mg/kg组、2.5mg/kg组较生理盐水组推进率分别减少0.68%、1.03%、4.03%。
6.3钩吻碱对消化道内菌群数量的影响，对回肠重量、消化酶活性、内容物的PH值的影响
取1d龄健康雏鸡60只，按单因素3处理2重复随机试验设计，第1组为对照组，第2、3组为试验组（分别添加1%,2%钩吻干粉），各组基础日粮相同，笼养，每天在8h与15h定时定量饲喂。试验的最后1d，喂饲2h后作颈静脉放血扑杀，打开腹腔，立即取出十二指肠、肌胃、肠道和胃内容物，分别测定其PH值，大肠杆菌数，乳酸杆菌数，消化酶的活性。
测定结果表明，回肠中的大肠杆菌，第2组比对照组低6.81%，而第3组含量显著低于对照组（P<0.05），其值降低10.42%。
回肠中的乳酸杆菌数，第2、3组与第1组之间差异不明显（P>0.05），但第2组和第3组较第1组的菌落数略有增多，其值分别增多2%和3.8%。
回肠鲜重，各组之间差异不明显（P>0.05）。但肌胃胃蛋白酶活性、十二指肠淀粉酶活性较第1组（对照组）明显提高，其值分别提高11.6%和26.0%。肌胃内容物的PH值，第2组较第1组仅降低0.18个单位，而第3组较第1组降低0.36个单位，差异明显（P<0.05），而十二指肠内容物的pH值；第2和第3组较第1组差异不明显（P>0.05）。
实验结果表明，钩吻碱能降低回肠中的大肠杆菌数量，提高乳酸杆菌浓度，增强胃蛋白酶和肠淀粉酶的活性，有利于消化吸收。
7．钩吻在肌肉和肝脏中的残留研究
采用薄层层析法，气相色谱法对日粮中添加2%钩吻干粉，饲喂30d，60d的肉鸡进行肌肉与肝脏钩吻碱残留量的检测。
检测结果显示，在程序升温条件下，钩吻素子标准品的保留时间为4.0min，在肌肉和肝中的标准品能检出，但在日粮中添加了2%钩吻干粉饲喂30d和60d的肉鸡的肌肉与肝脏、检测结果为阴性。从而说明钩吻碱在体内几乎不残留。
参考文献：
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2．易金娥,袁慧等.钩吻碱毒理机理研究.湖南农业大学学报(自然科学版)[J],2003,29(3).
3．易金娥,袁慧等.钩吻毒素的研究进展,湖南环境生物职业技术学院学报[J],2003,(1).
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6．袁慧,文利新等.钩吻对肉鸡血液学影响,湖南农业大学学报(自然科学版)[J],2003,29(专刊).
7．张冬英,袁慧.钩吻碱对动物血液学及免疫功能影响.硕士研究生论文，2003.
8．刘晓燕,袁慧.钩吻碱促生长作用机理及残留研究.硕士研究生论文，2003.
9．陈竟峰，袁慧.钩吻总碱的提取、分离、鉴定及其一般毒性的研究，硕士研究生论文，2002.
10．易金娥,袁慧.钩吻的毒性机理与毒性病理学研究.硕士研究生论文，2002.
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