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2.抗体检测技术
CSF抗体水平检测是疫苗免疫效果评价的主要方法，ELISA方法以其操作简便、敏感、检测样本量大等优点成为其主要手段。目前市场上众多的ELISA试剂盒，检测效果最好和最稳定的仍是进口试剂盒，尤其是idexx公司的CSF抗体检测试剂盒，因此研发国产化的准确度高的CSF抗体ELISA检测试剂盒势在必行。我们采用杆状病毒表达系统获得CSFVE2基因可溶性表达产物(专利受理书编号200810223406.0)，突破了诊断用抗原的关键制备技术：对单抗WH303进行纯化和FITC标记。分别建立了CSF间接ELISA方法和阻断ELISA方法。抗体间接ELISA方法：采用中和实验作为金标准与间接ELISA对232个阳性样本和242个阴性样本进行符合实验，其敏感性符合率为90.95% ，特异性符合率为94.21%，两种方法的总符合率为92.62%。该方法具有操作简便，灵敏度高等特点，通过对血清中E2蛋白多抗的检测，可全面反应猪体内抗体水平，适用于田间大规模免疫抗体水平普查、商品猪场免疫效果评价和不同免疫水平猪群的分群。抗体阻断ELISA检测方法：对PRRSV、PRV、PCV、PPV、BVDV等病毒性疾病抗体(CSF抗体为阴性)无交叉反应。对285份临床血清样本的检测结果表明，与IDEXX试剂盒的特异性为94.2%，敏感性为98%。两种方法的符合性为97.5%。由于采用单抗WH303作为酶标抗体，大大了降低非特异性反应。通过与idexx试剂盒比较，两种试剂盒检测效果相近。该方法除用于田间大规模普查外，尤其适用于规模化种猪场和重点疫区抗体监测。制备成本较低，稳定性好，为我国CSF抗体水平的监测提供了重要的技术支持。
三、建立了猪瘟兔化弱毒疫苗效检替代方法及疫苗中牛病毒性腹泻病毒检测方法的研究
猪瘟兔化弱毒株是世界公认的最安全、免疫效果最好的疫苗毒株，也是我国唯一使用的猪瘟疫苗毒株。家兔热反应是疫苗效价测定和成品效力检验的主要方法，难免检测结果准确性不佳，主要与实验动物个体差异和标准化程度不高、检测周期长有关，无疑提高了疫苗储藏成本，滞后了疫苗上市时间。必须对现有检测方法进行标准化研究，同时还必须采用新技术，建立新的准确简便的替代方法，提高疫苗检测质量，对其质量监控至关重要。我们建立了HCLV荧光定量PCR方法(HCLV-FQ-PCR)，为疫苗兔热效检代替方法研究奠定了基础，能定量检测HCLV的病毒滴度，为疫苗效力检验提供了一种快速、敏感、特异的方法。同时还建立了CSFV单抗WH303直接免疫荧光检测方法，该方法特异性好，比荧光多克隆抗体更敏感，荧光背景值较低，更容易观察结果。对34份CSF疫苗同时进行兔热反应、HCLV-FQ-PCR检测、TCID50测定，发现三者之间存在良好的相关性，用HCLV-FQ-PCR及/或TCID50测定可以指导CSF疫苗的生产，对荧光定量CT值在17.10-20.81，病毒含量在8.27×104copy/μL-1.11×106copy/μL：或TCID50值在10-2.88/0.1ml-10-4.54/0.1ml之间的疫苗半成品原液，可以按半成品疫苗原液每毫升能引起100万个兔体定型热反应进行配苗。采用HCLV-FQ-PCR方法及CSF单克隆抗体直接免疫荧光方法测定疫苗生产中间产品的效价，代替传统的兔热反应方法，从而更准确、快速指导疫苗的生产，缩短疫苗生产周期，节约生产成本，产生更明显的经济和社会效益。
牛病毒性腹泻病毒也称牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(BoVine Viral Diarrhea-Mucosal Disease Virus，BDV-MDV)，在分类学上属于黄病毒科(FlaViViridae)瘟病毒属。国内外已有相关报道表明犊牛血清中存在BVDV污染，造成仔猪BVDV先天性感染，出现CSF类似症状与病变。所以在CSF细胞疫苗生产过程中，对原材料中BVDV检测是必不可少的。我们建立了BVDV-FQ-PCR方法，该方法只扩增BVDV，不扩增BVDV以外病原，与RT-PCR符合率为99.1%。通过对58份不同厂家不同批次的CSF疫苗半成品进行检测发现，污染率达20.7%：对不同厂家不同批次36份CSF成品检测发现污染率高达22.2%。具有快速、敏感、特异的特点，为CSF疫苗原材料BVDV污染检测提供了技术支持，保障CSF疫苗的质量。
四、猪瘟病毒致病机制及标记疫苗的研究
CSFV的3’UTR被认为与病毒基因组的复制、翻译以及复制和翻译的调控有关，序列比对发现猪瘟病毒兔化弱毒疫苗株(HCLV)的3’UTR核苷酸的第61位有一个12-nt(CUUUUUUCUUUU)的插入序列，这在强毒SM株以及其它毒株中是没有的。为研究这一特征性序列的生物学功能，特别是HCLV在减毒中是否发挥了重要作用，构建两个突变株感染性cDNA克隆，一株是在强毒SM株基因组pT7SM感染性cDNA克隆3’UTR的第61 位处插入了12个碱基“CTTTTTTCTTTT”，定名为pT7SM3’-+12：另一个是pT7SM的3’UTR完全被HCLV基因组3’UTR所替换，名为pT7SM3’-239。经拯救得到两株突变株病毒VT7SM3′-+12和VT7SM3′-239，分别在细胞和动物水平研究了突变株病毒的增殖特性和毒力变化情况。结果两个突变株在PK-15细胞上的病毒增殖滴度比其亲本株下降了约100倍：对实验用猪产生了明显减毒的现象，有效地诱导宿主产生中和抗体，并可以使宿主完全抵抗致死剂量的SM强毒的攻击，这种特性和HCLV十分类似。表明HCLV 3’UTR的 12个碱基插入对CSFV复制和毒力有着重要影响，与疫苗减毒有重要关系。该结果也提示CSFV的非编码区突变可以影响病毒的毒力，这对理解CSFV的减毒机理以及开发新一代疫苗提供理论依据。
由于HCLV接种猪与自然感染猪不能从血清学上予以区分，我国CSF防控实行的是强制免疫措施，开发CSF标记活疫苗对于我国CSF净化和参与国际贸易具有现实意义。我们运用反向遗传操作技术，在实验室已构建的C株感染性克隆的基础上，在E1的C末端插入FLAG基因作为标记分子，构建含有FLAG基因的猪瘟兔化弱毒标记毒株VC-FLAG的感染性克隆，并成功拯救出含有FLAG标记的VC-FLAG病毒。通过病毒的细胞适应性实验，证明VC-FLAG病毒可以适应多种猪源细胞，证明了SK6细胞系是培养VC-FLAG的最适细胞系，探索出了使用带毒细胞混合正常细胞进行传毒的病毒传代方法。不同代次病毒经免疫组化、RT-PCR和核苷酸序列测定证明嵌合病毒能稳定表达标记抗原，且在细胞中传代的遗传稳定性良好，为CSF标记疫苗研究奠定了基础。
五、国际合作交流成就
欧洲也是CSF流行的一个重要区域，在CSF的研究中处于领先地位。几年来，我们加强和欧洲的交流及合作，提升了科技创新能力，解决CSF准确诊断的关键问题：建立了良好的国际合作渠道，提升了该实验室的国际地位，建立并完善我国系列CSF诊断技术，进而改进和完善我国CSF预防控制策略。
应欧盟CSF参考实验室邀请，我们连续2年每年参加欧盟CSF参考实验室组织的来自42个国家50个实验室的CSF年会和诊断比对实验，掌握了欧洲CSF流行现状，分析欧盟CSF防控技术对我国的影响，对我国CSF防控乃至净化具有很好的推动作用。采用本实验室建立的CSFV通用荧光RT-PCR方法、CSFV鉴别荧光MGB-RT-PCR方法和CSFVRT-nPCR方法，对欧盟CSF参考实验室在2009年提供的18个和2010年提供的16个病原盲样进行检测，结果与欧盟CSF参考实验室完全一致：采用本实验室建立的CSF抗体间接ELISA和CSF抗体阻断ELISA方法，对上述盲样进行检测，仅间接ELISA对一个盲样反应结果为阴性或可疑，其余样本完全符合。2次国际比对、国内比对以及我们的大量实验结果显示，我们研制的系列方法弥补了我国CSF病原检测的空白，组装的CSF病原检测试剂盒相关指标达到欧盟参考实验室技术标准，抗体检测试剂盒相关指标达到了进口商品化试剂盒的标准，相关成果已申请专利保护，正申请新兽药临床试验。可实现CSF病原检测和CSF抗体检测试剂盒的国产化，提升我国CSF诊断水平，为获得国际贸易认可铺平了道路，为CSF防控和净化扫清了障碍，具有很好的推广应用前景和极大的产业化价值。
六、猪瘟净化策略研究
CSF是我国政府计划要根除的重要传染病，近年来对科研投入资金力度逐年加强。因此，我们通过十年坚持不懈地研究，取得了上述成就，提升了我所CSF研究在国际上的影响力。上述一切工作的最终目的，是为我国CSF防控与净化铺垫基础。在我们主持的十一五支撑计划《猪瘟、猪伪狂犬病综合防空集成与示范》的支撑下，在华中农业大学、四川农业大学、军事医学科学院军事兽医研究所、中国农业科学院哈尔滨兽医研究所及湖北省农业科学院畜牧兽医研究所等国内CSF及猪伪狂犬病研究处于领先地位的6个研究单位的共同努力下，课题组在15个规模化养猪示范场开展了CSF及猪伪狂犬病的综合控制及净化工作，最终使9个场净化了CSF，取得了显着的成效。(注：本项报告仅涉及CSF净化)
在上述技术集成的基础上，按照准备阶段→控制阶段→强制净化阶段→监测阶段→认证阶段等五个净化程序，通过对CSF快速诊断试剂盒、疫苗毒株和致病毒株鉴别诊断方法的筛选和整合，免疫程序的调整，生物安全措施的综合实施。根据病原污染程度，将示范场分为严重污染场和一般污染场实施净化。对CSF严重污染场，CSF病原阳性率分别从2006年的7.08%～11.49%下降至2010年的0%～2.07%，达到基本清除CSF的目标：对CSF一般污染场，阳性率分别从0.87%～3.09%下降至0%，清除CSF。CSF免疫合格率总体上升，从2006年的67.30%～90.67%上升至2010年的85.00%～96.32%。达到了基本无疫或无疫，成功地在部分种猪场实现了CSF的控制与净化，建立了不同净化模式。
示范场生产指标得到了全面改善，经济效益稳步提升，如湖北省二场三场从亏损32万元到2010年赢利60.1万元，北京养猪育种心从2007年赢利120万元至2009年赢利520万元。同时，开展各个层次针对性技术培训，组建专门的净化技术组，提升了养猪场的理论水平和疫病防控能力。通过近3年在15个示范场CSF的综合防控及净化，构建了符合我国国情的规模化猪场CSF和猪伪狂犬病的不同净化模式，形成了一系列的指导方案，制定了《规模化猪场猪瘟、猪伪狂犬病综合防控技术集成与示范实施方案》、《规模化猪场猪瘟净化技术指南》、《集约化、规模化猪场生物安全体系的实施方案》和《“猪瘟、猪伪狂犬病综合防控技术集成与示范”课题种猪净化认证方案建议》等指南，取得的重要创新性成果，可用于指导我国CSF的防控和净化。
结语：
CSF困扰我国养猪业已经半个多世纪，目前依然是各级政府计划要根除的重大猪病。通过我们十年的流行病学研究，发现CSF的病毒基因组比较稳定，变异的频率较低，且只有一个血清型，这对该病毒的清除是一个有利的条件。更为重要的是，我们研发的诊断技术已经达到国际技术标准，并被国际上认可。数据还表明由我国的CSF疫苗依然是最优秀的疫苗，为CSF的控制和根除提供了技术保障。尤其是十一五期间对我国部分养猪场净化CSF的成功先例表明，现阶段在我国目前的流行状态下，在规模化猪场和部分区域开展CSF的净化是完全可行的。
